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WB實驗結果“膜上一片空白”怎么回事?


發布日期:[2019-04-02] 共閱[258]次

    勁馬專注科研試劑盒的研發及銷售多年,涉及分子生物學、細胞生物學、免疫學等生命科學的各個領域,滿足您實驗所需,以實現與客戶的雙贏,完善的庫存及供應體系以及高效穩定的專業技術,保證產品均能現貨供應。期待您前來咨詢選購。今天小編給大家帶來的是:WB實驗結果“膜上一片空白”,什么原因導致的呢?一起來看看吧!

    一、膠和膜放反了:如果在轉印的過程中,膠和膜的位置顛倒了,那么蛋白就從膠上轉移到緩沖液中,而不會到達膜上。對于標準的轉印,凝膠應靠近三明治的負極,而膜對應正極。

    二、轉膜效率低:轉膜效率受多種因素影響,包括蛋白的大小、凝膠中丙烯酰胺的百分比、電場強度、轉印時間和緩沖液的PH值。一般來說,蛋白越大,轉移的越慢。轉移大蛋白zui好的方法是用高的電場強度。而小蛋白長時間處于高電場強度下可能會傳出轉印膜。避免這個問題的方法是用0.2μm孔徑的PVDF膜進行轉印。如果蛋白的等電點接近緩沖液的pH值,那么這個蛋白攜帶的電荷很少,在電場中頁幾乎不移動。如果你的目的蛋白是強堿性的,那么你可以用碳酸鹽(pH9.9)、CAPS(pH11)及酸性緩沖液。

    三、試劑放置太久或存放條件不正確:抗體會慢慢降解,如果反復凍融的話,它會快速降解。底物應儲存在-20℃。

    四、抗體不純或滴度太低:一抗的濃度差異很大,應該根據經驗來決定一抗的稀釋度。一般的原則是以1:100-1:1000來稀釋血清或組織培養上清,以1:1000-1:10000來稀釋腹水或超免疫動物的血清。Bio-Rad的印跡級別的二抗稀釋度是1:3000。

    五、酶失活了:疊氮鈉是辣根過氧化物酶的抑制劑。不要再HRP顯色的western blot中使用任何含疊氮鈉的試劑。疊氮鈉可以用于堿性磷酸酶結合的抗體中,而無副作用。另外,只能使用蒸餾的去離子水。

    六、使用Tween-20洗滌:Tween-20(吐溫-20)可能會干擾某些抗體-抗體相互作用,或洗去PVDF膜上的目的蛋白。因此除了封閉之后的第一次洗滌,其他洗滌過程中都不使用Tween-20。

    七、檢測系統缺乏足夠的靈敏度:確保蛋白的上樣量在檢測系統的靈敏度范圍內。

    勁馬成為國內生命科學領域ELISA試劑盒的主要供應商之一,代理許多國際先進水平的高科技試劑盒,包括分子生物學、細胞生物學、免疫學等多個研究及應用領域,期待能與更多科研單位深入合作,共同打造生物行業一片藍天。

 

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